Peptidy sú triedou zlúčenín vytvorených spojením viacerých aminokyselín prostredníctvom peptidových väzieb.Sú všadeprítomné v živých organizmoch.Doteraz boli v živých organizmoch nájdené desiatky tisíc peptidov.Peptidy hrajú dôležitú úlohu pri regulácii funkčných aktivít rôznych systémov, orgánov, tkanív a buniek a v životných aktivitách a často sa používajú vo funkčnej analýze, výskume protilátok, vývoji liekov a iných oblastiach.S rozvojom biotechnológie a technológie syntézy peptidov sa v klinickej praxi vyvíja a používa stále viac peptidových liekov.
Existuje široká škála peptidových modifikácií, ktoré možno jednoducho rozdeliť na postmodifikačnú a procesnú modifikáciu (pomocou odvodenej modifikácie aminokyselín), a N-koncovú modifikáciu, C-koncovú modifikáciu, modifikáciu bočného reťazca, modifikáciu aminokyseliny, modifikáciu skeletu, atď., v závislosti od miesta úpravy (obrázok 1).Ako dôležitý prostriedok na zmenu štruktúry hlavného reťazca alebo skupín vedľajších reťazcov peptidových reťazcov môže modifikácia peptidov účinne zmeniť fyzikálne a chemické vlastnosti peptidových zlúčenín, zvýšiť rozpustnosť vo vode, predĺžiť dobu pôsobenia in vivo, zmeniť ich biologickú distribúciu, eliminovať imunogenicitu. V tomto článku je predstavených niekoľko hlavných stratégií modifikácie peptidov a ich charakteristiky.
1. Cyklizácia
Cyklické peptidy majú mnoho aplikácií v biomedicíne a mnohé prírodné peptidy s biologickou aktivitou sú cyklické peptidy.Pretože cyklické peptidy majú tendenciu byť rigidnejšie ako lineárne peptidy, sú extrémne odolné voči tráviacemu systému, môžu prežiť v tráviacom trakte a vykazujú silnejšiu afinitu k cieľovým receptorom.Cyklizácia je najpriamejším spôsobom syntézy cyklických peptidov, najmä pre peptidy s veľkou štruktúrnou kostrou.Podľa režimu cyklizácie je možné ho rozdeliť na typ s bočným reťazcom, koncový - postranný reťazec, koncový - koncový typ (typ end to end).
(1) sidechain-to-sidechain
Najbežnejším typom cyklizácie postranného reťazca na postranný reťazec je disulfidové premostenie medzi cysteínovými zvyškami.Táto cyklizácia je zavedená párom cysteínových zvyškov, ktoré sú zbavené chrániacej skupiny a potom oxidované za vzniku disulfidových väzieb.Polycyklickú syntézu možno dosiahnuť selektívnym odstránením sulfhydrylových ochranných skupín.Cyklizácia sa môže uskutočniť buď v post-disociačnom rozpúšťadle alebo na pred-disociačnej živici.Cyklizácia na živici môže byť menej účinná ako cyklizácia rozpúšťadla, pretože peptidy na živici netvoria ľahko cyklizované konformácie.Ďalším typom cyklizácie bočného reťazca - bočného reťazca je tvorba amidovej štruktúry medzi zvyškom kyseliny asparágovej alebo kyseliny glutámovej a aminokyselinou bázy, čo vyžaduje, aby sa ochranná skupina bočného reťazca dala selektívne odstrániť z polypeptidu buď na živici alebo po disociácii.Tretím typom cyklizácie postranného reťazca je tvorba difenyléterov tyrozínom alebo p-hydroxyfenylglycínom.Tento typ cyklizácie v prírodných produktoch sa vyskytuje iba v mikrobiálnych produktoch a produkty cyklizácie majú často potenciálnu liečivú hodnotu.Príprava týchto zlúčenín vyžaduje jedinečné reakčné podmienky, preto sa pri syntéze konvenčných peptidov často nepoužívajú.
(2) terminál-postranný reťazec
Cyklizácia koncového bočného reťazca zvyčajne zahŕňa C-koniec s aminoskupinou lyzínového alebo ornitínového bočného reťazca, alebo N-koncový s bočným reťazcom kyseliny asparágovej alebo kyseliny glutámovej.Ďalšia cyklizácia polypeptidu sa uskutočňuje vytvorením éterových väzieb medzi koncovým C a serínovým alebo treonínovým bočným reťazcom.
(3) Koncový alebo čelný typ
Reťazcové polypeptidy môžu byť buď cyklované v rozpúšťadle, alebo fixované na živici cykláciou bočného reťazca.Nízke koncentrácie peptidov by sa mali používať pri centralizácii rozpúšťadiel, aby sa zabránilo oligomerizácii peptidov.Výťažok syntetického kruhového polypeptidu od hlavy k chvostu závisí od sekvencie reťazcového polypeptidu.Preto pred prípravou cyklických peptidov vo veľkom meradle by sa mala najskôr vytvoriť knižnica možných reťazených vedúcich peptidov, po ktorej by nasledovala cyklizácia, aby sa našla sekvencia s najlepšími výsledkami.
2. N-metylácia
N-metylácia sa pôvodne vyskytuje v prírodných peptidoch a je zavedená do syntézy peptidov, aby sa zabránilo tvorbe vodíkových väzieb, čím sú peptidy odolnejšie voči biodegradácii a klírensu.Najdôležitejšou metódou je syntéza peptidov s použitím derivátov N-metylovaných aminokyselín.Okrem toho sa môže použiť aj Mitsunobuova reakcia medziproduktov N-(2-nitrobenzénsulfonylchlorid) polypeptid-živica s metanolom.Tento spôsob sa použil na prípravu knižníc cyklických peptidov obsahujúcich N-metylované aminokyseliny.
3. Fosforylácia
Fosforylácia je jednou z najbežnejších posttranslačných modifikácií v prírode.V ľudských bunkách je viac ako 30 % proteínov fosforylovaných.Fosforylácia, najmä reverzibilná fosforylácia, hrá dôležitú úlohu pri riadení mnohých bunkových procesov, ako je signálna transdukcia, génová expresia, regulácia bunkového cyklu a cytoskeletu a apoptóza.
Fosforyláciu možno pozorovať na rôznych aminokyselinových zvyškoch, ale najbežnejšími cieľmi fosforylácie sú serínové, treonínové a tyrozínové zvyšky.Fosfotyrozínové, fosfotreonínové a fosfoserínové deriváty môžu byť buď zavedené do peptidov počas syntézy alebo vytvorené po syntéze peptidov.Selektívna fosforylácia sa môže dosiahnuť použitím zvyškov serínu, treonínu a tyrozínu, ktoré selektívne odstraňujú ochranné skupiny.Niektoré fosforylačné činidlá môžu tiež zaviesť skupiny kyseliny fosforečnej do polypeptidu dodatočnou modifikáciou.V posledných rokoch sa miestne špecifická fosforylácia lyzínu dosiahla pomocou chemicky selektívnej Staudinger-fosfitovej reakcie (obrázok 3).
4. Myristoylácia a palmitoylácia
Acylácia N-konca mastnými kyselinami umožňuje peptidom alebo proteínom viazať sa na bunkové membrány.Myridamoylovaná sekvencia na N-konci umožňuje, aby sa proteínkinázy rodiny Src a proteíny Gaq reverznej transkriptázy zamerali na väzbu na bunkové membrány.Kyselina myristová bola pripojená k N-koncu živice-polypeptidu použitím štandardných kopulačných reakcií a výsledný lipopeptid mohol byť disociovaný za štandardných podmienok a purifikovaný pomocou RP-HPLC.
5. Glykozylácia
Glykopeptidy ako vankomycín a teicolanín sú dôležité antibiotiká na liečbu bakteriálnych infekcií odolných voči liekom a iné glykopeptidy sa často používajú na stimuláciu imunitného systému.Okrem toho, keďže mnohé mikrobiálne antigény sú glykozylované, je veľmi dôležité študovať glykopeptidy na zlepšenie terapeutického účinku infekcie.Na druhej strane sa zistilo, že proteíny na bunkovej membráne nádorových buniek vykazujú abnormálnu glykozyláciu, vďaka ktorej hrajú glykopeptidy dôležitú úlohu pri výskume rakoviny a imunitnej obrany nádorov.Glykopeptidy sa pripravujú metódou Fmoc/t-Bu.Glykozylované zvyšky, ako je treonín a serín, sa často zavádzajú do polypeptidov pomocou fMOC aktivovaných esterom pentafluórfenolu na ochranu glykozylovaných aminokyselín.
6. Izoprén
Izopentadienylácia sa vyskytuje na cysteínových zvyškoch v bočnom reťazci blízko C-konca.Proteínový izoprén môže zlepšiť afinitu bunkovej membrány a vytvoriť interakciu proteín-proteín.Izopentadiénové proteíny zahŕňajú tyrozínfosfatázu, malú GTázu, molekuly cochaperónu, jadrovú laminu a centromérne väzbové proteíny.Izoprénové polypeptidy možno pripraviť použitím izoprénu na živici alebo zavedením cysteínových derivátov.
7. Polyetylénglykolová (PEG) modifikácia
Modifikácia PEG sa môže použiť na zlepšenie hydrolytickej stability proteínu, biodistribúcie a rozpustnosti peptidu.Zavedenie PEG reťazcov do peptidov môže zlepšiť ich farmakologické vlastnosti a tiež inhibovať hydrolýzu peptidov proteolytickými enzýmami.PEG peptidy prechádzajú cez glomerulárny kapilárny prierez ľahšie ako bežné peptidy, čím sa výrazne znižuje renálny klírens.V dôsledku predĺženého aktívneho polčasu rozpadu PEG peptidov in vivo je možné udržiavať normálnu úroveň liečby nižšími dávkami a menej častými peptidovými liečivami.Avšak modifikácia PEG má aj negatívne účinky.Veľké množstvá PEG bránia enzýmu degradovať peptid a tiež znižujú väzbu peptidu na cieľový receptor.Nízka afinita PEG peptidov je však zvyčajne kompenzovaná ich dlhším farmakokinetickým polčasom a tým, že sú PEG peptidy prítomné v tele dlhšie, majú väčšiu pravdepodobnosť, že budú absorbované do cieľových tkanív.Preto by špecifikácie PEG polyméru mali byť optimalizované pre optimálne výsledky.Na druhej strane sa PEG peptidy akumulujú v pečeni v dôsledku zníženého renálneho klírensu, čo vedie k makromolekulárnemu syndrómu.Preto musia byť modifikácie PEG navrhnuté opatrnejšie, keď sa peptidy používajú na testovanie liečiv.
Bežné modifikačné skupiny PEG modifikátorov možno zhruba zhrnúť takto: Amino (-amín) -NH2, aminometyl-Ch2-NH2, hydroxy-OH, karboxy-Cooh, sulfhydryl (-Tiol) -SH, maleimid -MAL, sukcínimidkarbonát - SC, sukcínimidacetát -SCM, sukcínimidpropionát -SPA, n-hydroxysukcínimid -NHS, akrylát-ch2ch2cooh, aldehyd -CHO (ako propional-ald, butyrALD), akrylová báza (-akrylát-acrl), azido-azid, biotinyl - Biotín, fluoresceín, glutaryl-GA, akryláthydrazid, alkín-alkín, p-toluénsulfonát-OTs, sukcinimid sukcinát-SS, atď.Aminoaktivovaný PEG môže byť spojený s bočnými reťazcami kyseliny asparágovej alebo kyseliny glutámovej.Mal-aktivovaný PEG môže byť konjugovaný s merkaptánom z cysteínových bočných reťazcov, ktoré sú úplne zbavené ochrany [11].Modifikátory PEG sa bežne klasifikujú takto (poznámka: mPEG je metoxy-PEG, CH3O-(CH2CH2O)n-CH2CH2-OH):
(1) modifikátor PEG s priamym reťazcom
mPEG-SC, mPEG-SCM, mPEG-SPA, mPEG-OTs, mPEG-SH, mPEG-ALD, mPEG-butyrALD, mPEG-SS
(2) bifunkčný modifikátor PEG
HCOO-PEG-COOH, NH2-PEG-NH2, OH-PEG-COOH, OH-PEG-NH2, HCl·NH2-PEG-COOH, MAL-PEG-NHS
(3) vetviaci PEG modifikátor
(mPEG)2-NHS, (mPEG)2-ALD, (mPEG)2-NH2, (mPEG)2-MAL
8. Biotinizácia
Biotín sa môže silne viazať s avidínom alebo streptavidínom a sila väzby je dokonca blízka kovalentnej väzbe.Biotínom značené peptidy sa bežne používajú v imunotestoch, histocytochémii a prietokovej cytometrii založenej na fluorescencii.Na viazanie biotinylovaných peptidov sa môžu použiť aj značené antibiotínové protilátky.Biotínové značky sú často pripojené k lyzínovému bočnému reťazcu alebo N-koncu.Kyselina 6-aminokaprónová sa často používa ako väzba medzi peptidmi a biotínom.Väzba je flexibilná vo väzbe na substrát a lepšie sa viaže v prítomnosti stérickej prekážky.
9. Fluorescenčné značenie
Fluorescenčné značenie sa môže použiť na sledovanie polypeptidov v živých bunkách a na štúdium enzýmov a mechanizmov účinku.Tryptofán (Trp) je fluorescenčný, takže ho možno použiť na vnútorné značenie.Emisné spektrum tryptofánu závisí od periférneho prostredia a znižuje sa s klesajúcou polaritou rozpúšťadla, čo je vlastnosť, ktorá je užitočná na detekciu peptidovej štruktúry a väzby na receptor.Fluorescencia tryptofánu môže byť uhasená protónovanou kyselinou asparágovou a kyselinou glutámovou, čo môže obmedziť jej použitie.Dansylchloridová skupina (Dansyl) je vysoko fluorescenčná, keď je naviazaná na aminoskupinu a často sa používa ako fluorescenčná značka pre aminokyseliny alebo proteíny.
Fluorescenčná rezonancia Konverzia energie (FRET) je užitočná pre enzýmové štúdie.Keď sa aplikuje FRET, substrátový polypeptid zvyčajne obsahuje skupinu značiacu fluorescenciu a skupinu zhášajúcu fluorescenciu.Značené fluorescenčné skupiny sú zhášané zhášačom prostredníctvom nefotónového prenosu energie.Keď je peptid disociovaný z príslušného enzýmu, značiaca skupina emituje fluorescenciu.
10. Polypeptidy v klietke
Klietkové peptidy majú opticky odstrániteľné ochranné skupiny, ktoré chránia peptid pred väzbou na receptor.Pri vystavení UV žiareniu sa peptid aktivuje, čím sa obnoví jeho afinita k receptoru.Pretože táto optická aktivácia môže byť riadená podľa času, amplitúdy alebo miesta, klietkové peptidy sa môžu použiť na štúdium reakcií vyskytujúcich sa v bunkách.Najbežnejšie používanými ochrannými skupinami pre polypeptidy v klietke sú 2-nitrobenzylové skupiny a ich deriváty, ktoré môžu byť zavedené pri syntéze peptidov cez ochranné deriváty aminokyselín.Deriváty aminokyselín, ktoré boli vyvinuté, sú lyzín, cysteín, serín a tyrozín.Deriváty aspartátu a glutamátu sa však bežne nepoužívajú kvôli ich náchylnosti na cyklizáciu počas syntézy a disociácie peptidov.
11. Polyantigénny peptid (MAP)
Krátke peptidy zvyčajne nie sú imúnne a musia byť spojené s nosnými proteínmi, aby sa vytvorili protilátky.Polyantigénny peptid (MAP) je zložený z viacerých identických peptidov spojených s lyzínovými jadrami, ktoré môžu špecificky exprimovať vysoko účinné imunogény a môžu sa použiť na prípravu párov peptid-nosič proteín.Polypeptidy MAP možno syntetizovať syntézou na pevnej fáze na MAP živici.Neúplná väzba však vedie k chýbajúcim alebo skráteným peptidovým reťazcom na niektorých vetvách, a teda nevykazuje vlastnosti pôvodného MAP polypeptidu.Alternatívne môžu byť peptidy pripravené a purifikované oddelene a potom spojené s MAP.Peptidová sekvencia pripojená k peptidovému jadru je dobre definovaná a ľahko charakterizovaná hmotnostnou spektrometriou.
Záver
Modifikácia peptidov je dôležitým prostriedkom pri navrhovaní peptidov.Chemicky modifikované peptidy si môžu nielen udržať vysokú biologickú aktivitu, ale tiež účinne zabrániť nevýhodám imunogenicity a toxicity.Chemická modifikácia môže zároveň poskytnúť peptidom nové vynikajúce vlastnosti.V posledných rokoch sa rýchlo vyvinula metóda aktivácie CH na post-modifikáciu polypeptidov a dosiahli sa mnohé dôležité výsledky.
Čas odoslania: 20. marca 2023